在生物學和醫學研究中，細胞計數是一項基礎且重要的實驗技術。傳統的細胞計數方法如血球計數板雖然直觀，但操作繁瑣且易引入誤差。相比之下，比色法，特別是MTT（3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，即噻唑藍）比色法，以其高靈敏度和經濟性，在細胞存活和生長檢測中得到了廣泛應用。本文將詳細介紹MTT比色法的原理、實驗步驟及其在細胞計數中的應用。

MTT比色法原理

MTT比色法是一種基于活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性的檢測方法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性的MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞內。而死細胞由于缺乏此酶活性，無法形成甲瓚結晶。隨后，利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細胞中的甲瓚結晶，并通過酶聯免疫檢測儀在特定波長（通常為490nm或570nm）下測定其光吸收值（OD值），從而間接反映活細胞的數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

實驗步驟

1. MTT溶液的配制

• 材料：MTT粉末、磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）或無酚紅的培養基、0.22μm濾膜、鋁箔紙。

• 步驟：稱取MTT 0.5克，溶于100ml PBS中，用0.22μm濾膜過濾以除去細菌，放4℃避光保存。配制過程中，容器最好用鋁箔紙包住以避免光照分解。

2. 細胞接種與培養

• 材料：培養瓶、96孔板、移液管、培養基（含10%胎小牛血清）、胰蛋白酶等。

• 步驟：收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度至適當范圍（如1000-10000個/ml），接種于96孔板中，每孔加入100-200μl細胞懸液，置于37℃、5% CO2培養箱中培養至細胞貼壁或達到實驗所需狀態。

3. MTT處理與孵育

• 步驟：向每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），繼續培養4小時。MTT被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為甲瓚結晶并沉積在細胞內。

4. 結晶溶解與比色

• 步驟：終止培養后，小心吸去孔內培養液（對于懸浮細胞需先離心）。每孔加入100μl DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶聯免疫檢測儀在490nm或570nm波長下測定各孔的光吸收值（OD值）。

5. 數據處理與分析

• 步驟：記錄各孔的OD值，根據實驗設計進行數據處理和分析。通常，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，以反映細胞增殖情況。

應用與注意事項

應用

MTT比色法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等領域。其高靈敏度和經濟性使得該方法成為細胞生物學研究中的重要工具。

注意事項

1. MTT溶液的配制與保存：MTT溶液應現用現配，避免反復凍融。配制好的溶液應置于4℃避光保存，并在兩周內使用完畢。

2. 細胞接種濃度與培養時間：選擇合適的細胞接種濃度和培養時間對于實驗結果的準確性至關重要。不同細胞類型的最佳接種濃度和培養時間可能有所不同，需通過預實驗確定。

3. 實驗條件控制：實驗過程中應嚴格控制培養條件（如溫度、CO2濃度等），以減少外界因素對實驗結果的影響。

4. OD值范圍：為了保證實驗結果的線性關系，MTT實驗的OD值最好在0-0.7范圍內。超出此范圍時，OD值與細胞數之間的線性關系可能不再成立。

5. 防止污染：實驗過程中應注意無菌操作，避免細胞污染對實驗結果的影響。

結論

MTT比色法作為一種高效、靈敏的細胞計數方法，在生物學和醫學研究中具有廣泛的應用前景。通過掌握其原理、實驗步驟及注意事項，可以更加準確地進行細胞計數和生長狀況分析，為科學研究提供有力支持。