在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體污染是一個(gè)常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題。支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間的原核生物，形態(tài)多樣，沒(méi)有細(xì)胞壁，且能夠直接穿過(guò)常規(guī)的除菌濾膜，因此極易造成細(xì)胞培養(yǎng)污染。支原體污染不僅會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝，還可能改變細(xì)胞的基因表達(dá)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

一般情況下，細(xì)胞感染支原體，我們建議直接丟棄并對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒處理，但總有一些特殊情況，導(dǎo)致我們不能丟棄辛苦培養(yǎng)的細(xì)胞，這時(shí)就可以派細(xì)胞用支原體祛除試劑上場(chǎng)了。

1、對(duì)于已發(fā)生支原體污染的細(xì)胞，不愿隨意丟棄，希望繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，可選擇Zell Shield®細(xì)胞支原體祛除試劑（貨號(hào)：13-0050/13-0150）。

如已轉(zhuǎn)染或大量擴(kuò)增的細(xì)胞等情況，需要對(duì)已被支原體污染的細(xì)胞進(jìn)行拯救。使用含有復(fù)合抗生素成分的Zell Shield®細(xì)胞支原體祛除試劑，可以抑制支原體蛋白和DNA合成，同時(shí)對(duì)細(xì)菌和真菌也有抑制作用。

先使用廠家推薦的“懸浮沖洗法"處理好細(xì)胞，再使用加了Zell Shield®細(xì)胞支原體祛除試劑的培養(yǎng)基養(yǎng)細(xì)胞，按照使用說(shuō)明進(jìn)行操作，使用Zell Shield®細(xì)胞支原體祛除試劑培養(yǎng)4代后，細(xì)胞中的支原體即可祛除。

懸浮沖洗法及試劑使用方法：

（1）消化細(xì)胞：將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化下來(lái)。

（2）離心：將消化好的細(xì)胞寄培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行常規(guī)離心。

（3）清洗細(xì)胞：棄上清后，用無(wú)菌PBS輕柔吹打清洗細(xì)胞。

（4）重復(fù)清洗：將PBS和細(xì)胞的混合物進(jìn)行低速離心，棄上清并重復(fù)清洗3次.

（5）重新培養(yǎng)：最后一次清洗結(jié)束后，棄掉PBS上清液，加入含有Zell Shield®細(xì)胞支原體祛除試劑的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，4代后，細(xì)胞中的支原體即可祛除。

2、對(duì)于無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)的珍貴樣本或病毒收獲液，則可以使用德國(guó)MB公司的Mynox®珍貴生物樣品支原體清除試劑（貨號(hào): 10-0200/ 10-0500/ 10-1000）。

該試劑含有「治療液」和「鞏固防護(hù)液」。「治療液」來(lái)自枯草桿菌提取物，可特異性地與支原體膜結(jié)合，改變支原體膜通透性，從而使支原體在2-3小時(shí)內(nèi)破潰死亡；「鞏固防護(hù)液」加入培養(yǎng)基，后續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月，細(xì)胞將會(huì)清除支原體的污染，確切有效。

使用方法：

（1）細(xì)胞重新傳代時(shí)，用含Mynox®珍貴生物樣品支原體清除試劑、5%FBS的的培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）孵育培養(yǎng)2-3小時(shí)。

（3）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。

（4）用不含Mynox®的正常培養(yǎng)基（原始培養(yǎng)條件）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，傳代3-4次。

（5）可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，觀察細(xì)胞狀態(tài)。

3、對(duì)于可以培養(yǎng)超過(guò)一個(gè)月的珍貴細(xì)胞株，如果需要對(duì)其進(jìn)行祛除支原體的處理，可以使用德國(guó)MB公司的Mynox® Gold珍貴細(xì)胞株支原體清除試劑（貨號(hào)：10-0201/ 10-0501/ 10-1001）。

該試劑分為直接殺除+鞏固防護(hù)兩步處理，祛除支原體的同時(shí)，可進(jìn)一步在后續(xù)培養(yǎng)中鞏固清除效果，防止支原體“卷土重來(lái)"。

使用方法：

（1）治療液與含5%FBS的培養(yǎng)及混合

（2）將混合后的治療液添加至培養(yǎng)皿中

（3）將接種細(xì)胞

（4）培養(yǎng)細(xì)胞至80%-90%匯合后，進(jìn)行傳代

（5）傳代的同時(shí)加入鞏固液

重復(fù)（4）（5）兩次

（6）在無(wú)Mynox® Gold的情況下傳代

（7）用Venor® Gem支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)