具體步驟

1.細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。將融化的細(xì)胞移入離心管中，加入37oC預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基中（其中胎牛血清約為10%），輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/瓶中，在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細(xì)胞傳代

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%（過早產(chǎn)量不足，過晚細(xì)胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng)，一般1:3至1:5細(xì)胞一代，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間，非細(xì)胞有絲分裂次數(shù)）時(shí)，去掉*培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37oC。顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度）進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

加入適量DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗，棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照所需細(xì)胞量在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

3.細(xì)胞凍存

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，去掉*培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10% DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中加入血清一方面可以為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，另一方面可以在細(xì)胞凍存過程中提供非滲透性保護(hù)物質(zhì)，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護(hù)細(xì)胞），放入凍存管內(nèi)（管內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入4oC冰箱中凍存30min，然后放入-20oC冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細(xì)胞的活力。凍存細(xì)胞不加任何保護(hù)劑，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。

4.注意事項(xiàng)

（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；

（2）用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手；

（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染；

（4）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小；

（5）嚴(yán)格的無菌操作；

（6）貼壁細(xì)胞消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化；

（7）傳代細(xì)胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每種細(xì)胞使用一套器材。避免交叉感染；

（8）傳代細(xì)胞瓶口每次打開或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

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