具體操作：

（一）傳代前準(zhǔn)備

1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

2.用75％酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。

6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

（二）胰蛋白酶消化

1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。

2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

（三）吹打分散細(xì)胞

1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。

4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

（四）分裝稀釋細(xì)胞

1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。

（五）繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題。細(xì)胞培養(yǎng)中常遇見的有細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說(shuō)起支原體污染，估計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)就開始犯愁了，細(xì)胞培養(yǎng)的老手都知道，支原體污染非常不易察覺(jué)。有的實(shí)驗(yàn)室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效*的支原體清除，該實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無(wú)法進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，有的實(shí)驗(yàn)室甚至只能指望換細(xì)胞間。那么怎樣才能有效檢測(cè)并清除支原體污染呢?

有沒(méi)有什么方法能夠簡(jiǎn)單高效地祛除DNA污染呢？

當(dāng)然有：Minerva Biolabs PCR Clean™

通過(guò)中和以及降解的原理，可快速有效地祛除任何物體表面的DNA、RNA以及DNA酶、RNA酶的污染，使它們快速的降解，從而確保PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

使用方法也十分簡(jiǎn)單：

將PCR Clean™噴在操作臺(tái)表面，反應(yīng)1分鐘后，即可用干凈紙巾擦干試劑。

注：如果沒(méi)有擦拭干凈，液體揮發(fā)后表面可能有白色殘留，影響美觀。此時(shí)可用噴壺噴灑蒸餾水到白色殘留處，然后擦拭即可。

針對(duì)移液器需要去除DNA污染，可按照說(shuō)明書拆開移液器，將桿軸浸泡在PCR Clean™噴霧劑中，1分鐘后取出后用水沖洗，晾干，重新組合。